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由于在纽约自然历史博物馆担任警卫有出色表现，拉瑞（本·斯蒂勒BeStiller饰）出任某家电小公司的CEO，而且还在电视上接受了著名脱口秀主持人的访谈，儿子对他仰慕，爱情如影随形，一派春风得意的样子。不过，好景不长，当他故地重游，却意外发现馆长已经因为更新展览并准备把过时的展品挪到华盛顿的史密森博物馆继续展出。这让拉瑞感到有些气愤，他觉得自己有责任重振博物馆之雄风，于是他决定留下来再做一晚警卫，以唤起那些老朋友的共同努力。事实上，在搞定了罗斯福（罗宾·威廉斯RobiWilliams饰）、林肯、拿破仑、伊凡
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拉里·达利（本·斯蒂勒饰）生活似乎不太顺利：经常换工作，居无定所；妻子与他离婚，找了一个证券经纪人，即将再婚，自己在儿子心目中的地位也岌岌可危。达利为了挽救自己的生活，也为了争取到儿子的抚养权，他不得不放弃“做大事”的梦想，成为了纽约自然博物馆的夜间警卫。达利原本以为这是一份无聊的工作，谁知道上班的第一天，不可思议的事情就发生了：博物馆里的法老金牌拥有神奇的魔法，当夜晚来临的时候，馆中所有的标本都会活过来，追逐骨头的霸王龙、爱捣乱的猴子、暴虐的匈奴王、钻木取火的穴居人……将一切弄得不可开交。在26任总统特
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博物馆导游泰德热爱自己的工作，其博学热忱的讲解博得了带学生来此参观的漂亮女教师麦琪。老馆长却宣布了一个不幸的消息：由于参观的人数太少，博物馆面临着关张的窘境，唯一的拯救办法就是推出一项其他博物馆前所未见的新奇展品。老馆长出示给泰德一本带有地图的神秘日记，表明非洲扎格瓦部落迷失的一处圣陵所在，只要从中带回一尊大型神像，博物馆就有救了。泰德乘着轮船向非洲出发，到了丛林后找到了地图所示的古老神像，但完全不像老馆长描述的那样宏伟。而此刻一只顽皮的小猴对泰德发生了兴趣，一直尾随着他。在泰德动身离开非洲时，小猴子
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麦克斯是一名优秀的记者，在新闻圈子内享有盛名，不过在一次空难事件中他的报道没有现场感不再被上司重用。有一次他被派往一座博物馆作一次无关紧要的采访，但在这里他却正好赶上了一起劫持人质事件，而劫持人质的萨姆却是一个十分值得同情的人。他是一个本分的美国人，在麦克斯采访的这家博物馆作保安，他工作努力，在家里是一个好丈夫，也是两个孩子的好父亲，但他却被老板解雇了。在与老板论理时他一怒之下竟枪杀了以前要好的同事，并劫持了人质。麦克斯现场采访了萨姆，在了解这些情况后他决定帮助萨姆逃走，当他说服萨姆走出博物馆时，等待萨姆
